核酸合成儀是現(xiàn)代分子生物學(xué)、基因組學(xué)及生物醫(yī)藥研發(fā)的核心裝備，它能夠在體外高效、精準(zhǔn)地合成特定序列的DNA或RNAoligonucleotide（寡核苷酸）。其技術(shù)原理融合了固相合成技術(shù)、有機(jī)化學(xué)與精密自動(dòng)化控制，實(shí)現(xiàn)了對(duì)生命遺傳密碼的“按需編寫”。
 

　　一、核心原理：固相磷酸亞胺化學(xué)法

　　當(dāng)前主流的核酸合成技術(shù)均基于固相合成原理，其核心是磷酸亞胺化學(xué)法。該方法具有高效、高產(chǎn)率且易于自動(dòng)化的特點(diǎn)，取代了早期的磷酸二酯法和磷酸三酯法。整個(gè)合成過(guò)程在儀器的合成柱內(nèi)進(jìn)行，目標(biāo)鏈的合成方向是從3'端向5'端。

　　合成的一個(gè)循環(huán)主要包括四個(gè)基本步驟：

　　1.脫保護(hù)：

　　合成起始于共價(jià)連接在固相載體上的第一個(gè)核苷酸。該核苷酸的5'-羥基被保護(hù)基團(tuán)所封閉。循環(huán)的第一步是用酸溶液沖洗合成柱，脫掉第一個(gè)核苷酸5'端的DMT保護(hù)基，暴露出活性的5'-羥基，為下一步偶聯(lián)反應(yīng)做好準(zhǔn)備。脫下的DMT陽(yáng)離子呈橙色，可通過(guò)光度法在線監(jiān)測(cè)合成效率。

　　2.活化與偶聯(lián)：

　　接下來(lái)，儀器將下一個(gè)要被連接的核苷酸單體和活化劑同時(shí)泵入合成柱。核苷酸單體本身是高度活化的，其3'端通過(guò)磷酸亞胺基團(tuán)保護(hù)，5'端則由DMT保護(hù)，堿基上也有相應(yīng)的保護(hù)基。

　　活化劑會(huì)激活核苷酸單體的3'磷酸亞胺基團(tuán)，使其成為一個(gè)良好的親電試劑。隨后，它迅速與固相載體上已暴露的5'-羥基發(fā)生親核取代反應(yīng)，形成亞磷酸三酯鍵，從而將新的核苷酸加到正在延長(zhǎng)的寡核苷酸鏈上。

　　3.蓋帽：

　　偶聯(lián)步驟并非100%有效，總有極少數(shù)鏈的5'-羥基未能參與反應(yīng)。這些失敗的序列如果不被封閉，將在后續(xù)循環(huán)中繼續(xù)參與反應(yīng)，產(chǎn)生缺失序列的副產(chǎn)物。

　　“蓋帽”步驟使用兩種試劑的混合液對(duì)未反應(yīng)的5'-羥基進(jìn)行乙酰化封端，使其permanently失活。這些被“蓋帽”的短鏈在最終純化時(shí)會(huì)被去除，從而極大提高最終產(chǎn)物的序列正確性和純度。

　　4.氧化：

　　上一步偶聯(lián)形成的是不穩(wěn)定的亞磷酸三酯鍵，容易被酸分解。本步通入碘/水/吡啶的混合溶液，將其氧化成更穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，從而完成一個(gè)完整的核苷酸添加循環(huán)。

　　此后，儀器自動(dòng)重復(fù)上述“脫保護(hù)→偶聯(lián)→蓋帽→氧化”四個(gè)步驟，每一個(gè)循環(huán)添加一個(gè)新的核苷酸，直至整條目標(biāo)序列全部合成完畢。

　　二、合成后處理

　　核酸合成儀完成鏈的組裝后，所得產(chǎn)物仍是連接在固相載體上且所有基團(tuán)均被保護(hù)的DNA粗品。因此需要后續(xù)處理：

　　1.切割與脫保護(hù)：使用濃氨水溶液處理，一方面將合成的寡核苷酸鏈從CPG載體上切割下來(lái)，另一方面同步移除所有堿基上的保護(hù)基團(tuán)和鏈末端的DMT基團(tuán)。

　　2.純化：根據(jù)應(yīng)用需求，可通過(guò)高效液相色譜（HPLC）或聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）等進(jìn)行純化，以去除失敗序列和副產(chǎn)物，得到高純度的最終產(chǎn)品。

　　三、總結(jié)

　　核酸合成儀的本質(zhì)是一臺(tái)高度自動(dòng)化的精密有機(jī)化學(xué)反應(yīng)器。它通過(guò)將復(fù)雜的合成化學(xué)反應(yīng)分解為一系列可編程控制的標(biāo)準(zhǔn)化步驟，并由計(jì)算機(jī)精確控制液體流速、試劑用量和反應(yīng)時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)了DNA/RNAoligonucleotide的快速、高通量和精準(zhǔn)合成。這一技術(shù)的成熟與普及，極大地推動(dòng)了基因編輯、PCR檢測(cè)、核酸藥物、DNA存儲(chǔ)等前沿科技的飛速發(fā)展。